KROMATOGRAFI HPLC

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu jenis kromatografi, dimana kromatografi merupakan salah satu metode yang digunakan untuk memisahkan (separasi) suatu senyawa dari campuran senyawa lainnya. Prinsip kerja HPLC tak berbeda dengan prinsip kerja kromatografi pada umumnya, yakni menggunakan karakter distribusi senyawa antara fasa gerak dan fasa diam. Saat fasa gerak membawa senyawa melalui fasa diam, senyawa tersebut akan berada dalam kondisi kesetimbangan dinamik dan konstan di antara kedua fasa tersebut. Kesetimbagan dipengaruhi oleh kekuatan interaksi antara senyawa dengan fasa diam dan kompetisi antara senyawa dengan fasa gerak dalam berinteraksi dengan fasa diam. Fasa diam dapat berupa padatan atau cairan, sedangkan fasa gerak dapat berupa cairan atau gas.
Senyawa hanya akan dapat berpindah jika berada di dalam fasa gerak. Senyawa yang berbeda akan menghabiskan proporsi waktu (retention time) yang berbeda dalam fasa gerak dan fasa diam. Retention time adalah waktu yang dibutuhkan senyawa untuk bergerak saat pertama kali diinjeksikan ke dalam kromatografi hingga terukur peak maksimumnya. Retention time dipengaruhi oleh laju alir fasa gerak, sesuai dengan persamaan berikut:
VR = F . tR
VR adalah volume retention, F adalah laju alir fasa gerak, dan tR adalah retention time.
Kromatografi secara umum dapat diamati melalui perubahan pada absorbansi sinar ultraviolet (UV). Setiap senyawa akan memiliki karakteristik absorbansi yang berbeda-beda. Senyawa yang belum diketahui dapat diamati dengan baik menggunakan sinar UV pada panjang gelombang antara 200 – 220 nm (dekat dengan absorbansi akhir), sebab mayoritas senyawa organik pun memiliki absorbansi pada jarak spektrum tersebut. Penggunaan panjang gelombang yang lebih pendek cenderung mencakup absorbansi fasa gerak, sehingga dapat mengganggu pengamatan pada senyawa uji. Apabila absorbansi sinar UV tidak berpengeruh signifikan pada suatu senyawa, senyawa dapat diamati dengan menggunakan refractive index (RI) atau deteksi elektrokimia.
Salah satu cara untuk meningkatkan kinerja separasi menggunakan kromatografi adalah dengan menggunakan lebih dari 1 eluen sebagai fasa gerak. Seringkali penggunaan satu jenis eluen sebagai fasa gerak tidak dapat mengelusi seluruh campuran senyawa dari kolom. Penggunaan fasa gerak dengan eluen lebih dari satu jenis dapat memisahkan senyawa yang memiliki retention time yang berbeda jauh.
Salah satu kegunaan HPLC adalah untuk menganalisis bahan alam atau metabolit sekunder yang berada dalam tumbuhan. Metabolit sekunder merupakan molekul berukuran kecil (MR < 1500 da) yang dihasilkan suatu organisme, yang tidak berfungsi langsung dalam keberlangsungan hidup organisme tersebut. Jenis metabolit sekunder sangat banyak, namun dapat dikelompokkan menjadi 3 kelompok besar yang di antaranya fenol, terpenoid, dan alkaloid.

Pendeteksian bahan alam dari suatu tumbuhan sebagai contohnya dapat dilakukan pada tanaman kopi, Rauwolfia sp., serta tembakau. Bahan alam yang dapat dideteksi dari ketiga jenis tanaman tersebut di antaranya adalah metabolit sekunder dan asam lemak. Contoh metabolit sekunder yang terkandung dalam tembakau adalah nikotin. Nikotin dapat dianalisis dengan HPLC secara optimum dengan menggunakan eluen asetonitril:0.2 % asam format dalam air 80:20 (v/v) dan panjang gelombang 254 nm. Contoh asam lemak yang terdapat dalam tembakau adalah asam linoleat, dan dapat dianalisis dengan HPLC secara optimum menggunakan eluen asetonitril:air 80:20 (v/v) serta panjang gelombang 242 nm. Contoh metabolit sekunder dalam Rauwolfia sp. adalah reserpine, dan dapat dianalisis dengan HPLC secara optimum menggunakan eluen asetonitril:penyangga 35:65 serta panjang gelombang 268 nm. Contoh asam lemak dalam Rauwolfia sp. adalah siklopropana, dan dapat dianalisis dengan HPLC secara optimum menggunakan eluen n-heksana:2-propanol 90:10 (v/v) serta panjang gelombang 254 nm. Contoh metabolit sekunder dalam kopi adalah kafein, dan dapat dianalisis dengan HPLC secara optimum menggunakan eluen metanol:air 25:75 (v/v) serta panjang gelombang 254 nm. Sedangkan contoh asam lemak dalam kopi adalah asam palmitat, dan dapat dianalisis dengan HPLC secara optimum menggunakan gradien eluen 60 mM asam asetat:ACN:THF 35:60:5 hingga 0:90:10 serta panjang gelombang 210 nm

 

 

 

 

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s